液相色譜儀分析肉食品中常見4種抗生素殘留

   大環(huán)內(nèi)酯類與氯霉素類藥物是兩類應(yīng)用廣泛的廣普抗生素，由于這兩類抗生素能夠有效預(yù)防和治療家畜傳染病和寄生蟲病的發(fā)生，有些還具有促進動物生長發(fā)育的功用。因此，為了降低養(yǎng)殖成本，提高經(jīng)濟效益，在家畜養(yǎng)殖中廣為使用。但是，近年來由于在禽畜養(yǎng)殖過程中過量使用抗生素又不遵守休藥期的規(guī)定，在牛羊肉、豬肉以及雞鴨魚肉中檢測出了各種抗生素。這種殘留可以通過食物鏈進入人體，進而對人體造成各種危害。紅霉素、泰樂菌素等大環(huán)內(nèi)酯類可致肝損害和聽覺障礙。更嚴重的是長期大量濫用廣譜抗生素會導(dǎo)致腸道微生物菌群被抑制，使人體產(chǎn)生抗藥性，這種抗藥性導(dǎo)致人類感染疾病之后治療難度加大，治療成本升高?！　榱吮Ｕ先祟惖纳】?，世界各國衛(wèi)生組織以及食品藥品監(jiān)督管理部門都已經(jīng)將肉食品中各種抗生素殘留量作了嚴格規(guī)定，并且以抗生素在肉食品中的殘留量作為產(chǎn)品進口的貿(mào)易壁壘，如美國和歐盟對阿維菌素在肉食品中的zui高殘留*為25ug/kg，泰勒菌素為100ug/kg，替米考星為100ug/kg，伊維菌素為40ug/kg。目前肉食品中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素常用液一質(zhì)聯(lián)用進行全面分析。氯霉素類藥物常用氣相色譜及液相色譜分析。而用液相色譜法同時分析肉食品中兩類常見抗生素還未見文獻報道。

   一、LC2100高壓恒流泵：2臺
      uv2100紫外檢測器：1臺 N2000色譜工作站：1臺7725i手動進樣閥：1套

   色譜工作站：1套 

   二、LC2100液相色譜儀特點

★采用世界上zui的光學(xué)檢測系統(tǒng)（安捷倫液相色譜檢測系統(tǒng)），交差光路設(shè)計

★輸液泵單向閥來源自世界zui的輸液泵技術(shù)

★  傳承了美國瓦里安技術(shù)，確保了泵的可靠性及穩(wěn)定性

★  檢測器采用了安捷倫科技技術(shù)

★  在國內(nèi)同行業(yè)真正不需換燈，實現(xiàn)全波長可變檢測分析

★  智能化高，可實現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)化平臺監(jiān)控，提高了你的QC效益。

★  自動化，讓你從繁鎖的分析操作中解放出更多的時間！

技術(shù)特點

★ 輸液泵單向閥來源自瑞士進口、密封圈來自美國*、氘燈以及氘燈電源來自德國*、管路和各種接頭來源自美國*

★ 泵形式：串聯(lián)雙柱塞 浮動式密封圈；泵頭自沖洗功能，泵無須手動排空即可輸液

“自吸式單向閥"技術(shù)，可延長密封圈使用壽命；

★ 程序化的溶劑類和壓縮因子，可自動補償；完整的預(yù)清洗功能，更于快速溶劑更換

★ 三條流量校正曲線以及*的多點參數(shù)校正，保障了*的流量準確性； 

★ 梯度：高壓2-3元；梯度方式：高壓，梯度洗脫內(nèi)部軟件可自控制，可通過PC機及泵控制

★ 紫外檢測器具有自動波長定位調(diào)整，自動調(diào)零，多量程輸出選擇

★  D2燈（德國原裝）：壽命3500小時，保證使用2000小時

  三、高壓恒流輸液泵技術(shù)參數(shù)：

四、紫外可見檢測器技術(shù)參數(shù)

三、實驗

　　1 儀器與試劑

　京科瑞達　 LC-2100高壓恒流泵

　　uv2100紫外檢測器

　　超聲波清洗儀　　　　　　　　　　　　　

　　反相色譜柱C18　　

　　固相萃取柱　　　　　　　　　　　　　　　

　　泰樂菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考標準品均為天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心監(jiān)制　

　　乙腈、正己烷均為優(yōu)級純　

　　其它試劑均為分析純　

　　實驗用水均為二次蒸餾水　

　　新鮮牛肉與雞肉均為超市所購

　　2 色譜條件　　　　　　　　　　　

　　C18反相色譜柱　

　　柱溫25℃，流速1mL/min，進樣量25uL，梯度洗脫條件A相為甲醇，B相為0.2mol/L磷酸二氫鈉含10%(體積比)甲醇，調(diào)節(jié)pH為3.0，梯度洗脫程序：0-2min10%A，2-8min 10%-40%A，8-9min40%-10%A，檢測波長入為275nm

　　3 標準溶液的配制及標準曲線的制備

　　分別準確稱取各標準品0.01g（至0.001g），用甲醇分別溶解并定容至100mL，配制成100mg/L標準儲備液，于一4℃冰箱中冷藏，測定時將各標準溶液混合后稀釋成0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0mg/L的溶液。分別以泰樂菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考峰面積為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線，計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)（r）。

　　4 樣品處理

　　將新鮮牛肉及雞肉分別勻漿后，于-18℃冰箱中保存。測定時，將勻漿冷凍保存的牛肉與雞肉樣品于室溫下自然解凍。分別準確稱取20.0g樣品置于50mL具塞錐形瓶中，加入20mL乙腈，超聲10min，轉(zhuǎn)移至離心管，以5000r/min離心10min，收集上清液，離心沉淀物用上述方法重復(fù)提取2次，合并上清液。向得到的清夜中加入30mL正己烷，用力振蕩5min，靜置分層，棄去上層正己烷層。然后將溶液于40℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約2mL，氮氣吹干后加入5mL甲醇一磷酸鹽混合液超聲溶解抗生素，定容至10mL?！　　?/span>

　　5樣品凈化

　　將HLB固相萃取小柱用5mL甲醇、5mL去離子水活化后，將4得到的樣品處理液上固相萃取柱(柱流速保持1滴/s），用10mL蒸餾水、10mL5%甲醇水溶液淋洗固相萃取柱，再用10mL甲醇洗脫，將洗脫液用氮氣吹干后，加入流動相超聲定容至5mL，zui后，經(jīng)0.22um濾膜過濾后進樣?！　　　?/span>

　　6方法的準確度、精密度、線性范圍、回收率

對于牛肉樣品分別添加0.1、0.5、1.0mg/kg 3個水平的混合標準溶液，按照4與5樣品處理及凈化方法，每個水平平行測定4次，進行回收率實驗，并且以3倍信噪比分別計算泰樂菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考在牛肉樣品中的檢出限，在測定條件下4種藥物在0.1—20mg/L范圍內(nèi)均呈線性，線性方程與相關(guān)系數(shù)、平均回收率、相對標準偏差見表 　

 7、實際樣品檢測

本實驗分別對10份牛肉樣品和10份雞肉樣品中泰樂菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考進行檢測，沒有發(fā)現(xiàn)牛肉樣品中含有以上抗生素，但是在4份雞肉樣品中都不同程度檢測到了泰樂菌素，zui高為200ug/kg，zui低為80ug/kg，平均含量為120ug/kg，高于我國動物性食品中獸藥zui高殘留*（100ug/kg）

        我國動物性食品中獸藥zui高殘留*規(guī)定泰樂菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考在肉品中的zui高殘留量（MRL）分別為100、75、1.5、200ug/kg，本實驗所測泰樂菌素、替米考星、氟苯尼考的檢出限分別為20、32、16ug/kg均在zui高殘留*以下，符合殘留檢測分析要求。由于氯霉素藥物特殊性，歐盟對氯霉素的檢出限要求為0.1ug/kg，美國FDA對氯霉素的檢出限要求為0.3ug/kg，按照本實驗方法，氯霉素檢出限為19ug/kg，還未達到上的要求，這是因為提取方法和所用檢測器所致。今后應(yīng)該發(fā)展更加靈敏的方法以提高氯霉　素。本實驗方法的平均回收率較高（75%-87%），而且步驟簡單、操作容易、重現(xiàn)性較好　相對標準偏差為1.35%-5.41%，表明方法穩(wěn)定可靠。